图/显微观点
电脑运算是近 20 年来生物影像突破绕射极限的可靠工具,例如 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy),以电脑记忆、叠合,将多次拍摄的零散萤光重建成完整舆图,解析度极限可接近 10 纳米。
现在,透过电脑辅助的序列成像解析度增强术(RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging),科学家能将细胞内分子的定位解析度大幅提升到埃(Ångström, Å.等于1/10纳米)的尺度,清晰定位紧邻的分子、观察它们在细胞内的变化。
RESI 定位可呈现 DNA 相邻碱基间距,超越超解析显微镜,达到与电子显微镜同等的解析度,而且只需基本的细胞固定,近乎完全保持样本原貌。
在德国马克斯.普朗克生化研究所率领团队研发 RESI 的荣曼(Ralf Jungmann)认为,RESI 能填补介于光学显微术与结构生物学之间的资讯空白,揭露更多复杂生命系统的真相,为分子生物学与药物动力学开辟道路。
“发光顺序”成为解析度新要素
使 RESI 成为“超级超解析”定位术(super-super resolution)的核心概念,是以不同 DNA 萤光探针对目标进行多次标记定位,定位过程由电脑为目标编上号码(DNA-barcoding),使“发光顺序”成为分辨目标的新维度,并以“定位次数”来大幅提升解析度、为量化分析提供充沛样本。
CD20 的分布在 RESI 定位下一览无遗,透过 RESI 定位可发现,标靶药物 RTX 使癌细胞表面的 CD20 聚集成链状。图片来源:Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
例如,淋巴癌与自体免疫疾病的关键标靶:B 细胞表面 CD20 蛋白﹐虽然早已发现是重要的癌细胞特征,也确认有效药物,但其结构与分子动力学依然暧昧不明,学界对它的了解还不足以研发进一步疗法。
尽管 CD20 蛋白的结构已被电子显微镜呈现,但电子显微镜的拍摄条件会破坏细胞膜结构,导致 CD20 变形、偏移。现在透过 RESI 进行定位,CD20 的构造、药物效果,都可以在接近生理状态下一探究竟。
在 RES I分析下,荣曼等学者发现 CD20 总是成对出现(as dimers),并且在关键药物 RTX(一种抗 B 细胞的单株抗体)加入后,会在细胞膜上聚集成紧密的长链。这些资讯是过往电子显微镜与超解析光学显微镜都未曾展现的。
序列成像:以次序换取空间
各种超解析单分子定位术的共同难题,是两个目标分子过于接近,连电脑运算也无法辨别。假使两个距离 1 至 2 纳米的相同分子轮流被激发,PALM, STORM 等仰赖随机放光的超解析定位术即使分别收到两个光源的萤光讯号,重建时也容易将紧密的两者混为一点。
荣曼也强调,当两个萤光团的距离小于 10 纳米,近场光学效应会大幅影响光调控萤光染色分子(photoswitchable fluorescent dyes)的表现。分辨两个距离数纳米甚至数埃(Å)的分子,是单分子定位技术的最后关卡。
面对诺贝尔级超解析技术也无法克服的障碍,RESI 巧妙地以“标记”技术避开了光学难关。RESI 采用进化版本的 DNA-PAINT,萤光探针与目标结合转瞬即脱落,并能使相邻的目标结合不同探针,避免两者同时发光,两个紧密的分子几乎不会干扰彼此成像。
奠基于随机放光的单分子定位术(SMLM),序列成像(Sequential Imaging)用不同颜色、不同激发光谱的 DNA 萤光探针,标记邻近的两个目标,使两者轮流发光。如此一来,发光顺序便成为辨别萤光标记的新方法:两个目标距离仅 1 纳米左右,但因为发光顺序、萤光颜色不同,在重建过程中能够被电脑清楚区分。
在真实的细胞中,若想以不同嵌合片段(docking strands)标记邻近的相同蛋白(例如Nup96 dimer, CD20 dimer),则多少需要仰赖运气。目前的 RESI 使用随机标记(stochastically labelling),而非直接指定标记种类与位置。
以 RESI 定位核孔复合体的 Nup96 蛋白(图d.),可以达到电子显微镜的解析度(图 b.)。本实验对同一个核孔进行 4 轮标记定位(图d.),每次得到的定位资讯将重建叠合成最终定位图。图片来源:Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
定位 Nup96 的实验就是一个例子,荣曼团队的4种嵌合片段中,需要有 2 种分别标记相邻的 Nup96 蛋白,才能够使两个相邻蛋白分别依序发光。荣曼强调,得到理想标记的机率,会随着嵌合片段的种类提升。在荣曼团队的定位实验中,RESI 对 Nup96 的定位达到和扫描式电子显微镜同等精密的解析度。
荣曼认为:“理论上,透过发光顺序的差异,RESI 技术可以分辨无限接近的两点。”
定位次数带来解析度新境界
基于光波绕射的性质,点光源的光线不会透过显微镜聚焦为理想的一点,而是呈现一个立体球状照射范围。这个让科学家困扰一个半世纪的照射范围,就是此光学系统的点扩散函数(PSF, Point Spread Function)。
在显微镜焦平面上,PSF 会形成一个中心最亮、四周渐黯的圆形光斑(艾里斑,Airy Disk),若两个光点的光斑大幅重叠,就会难以辨别。这也就是远场光学显微镜的最大天然障碍:阿贝绕射极限的由来。
包含 PALM, STORM 等超解析技术的单分子定位显微术(SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy)也必须考虑 PSF。它们定位解析度(也称定位精准度,σSMLM),接近点扩散函数的标准差(σDiff)除以每次定位侦测光子数(N)的平方根:
σSMLM ≈ σDiff / N1/2
解析度数值愈小,代表辨别极限的距离愈近,定位结果愈清晰。超解析定位技术不断追求的,就是缩小 σSMLM。
在点扩散函数标准差(σDiff)随仪器性能固定的情况下,每次定位侦测的光子数 N 就是定位解析度的主要变数。多数单分子定位技术,都需要设法提升侦测光子数以看得更清晰。
与其他单分子定位术不同的是,RESI 采用的 DNA-PAINT 探针对目标分子反覆结合、脱落,不断有新的萤光探针前仆后继,迅速与目标短暂结合,可以对每个目标累积多次定位。
DNA-PAINT 技术可达到小于绕射极限的解析度,但 10 纳米内的构造依然难以辨识。加上 RESI 以定位顺序进行辅助,可以将解析度提升近百倍,达到 10 埃的尺度。图片出处:S. C. M. Reinhardt et al., Nature 617, 711 (2023)
因此目标的“定位次数”(K)进入解析度数值核心。每个目标定位的解析度由单次定位的点扩散函数标准差(σSMLM),转变为多次放光定位的平均值标准误差(SEM, Standard Error of the Mean),其大小和定位次数(k)的平方根成反比。
SEM≈ σSMLM / k1/2 ≈ (σDiff / N1/2) / k1/2
此时只要提升定位次数(k),就可以得到更精密的定位(σRESI),毋须追求更强或更漫长的萤光来增加每次侦测的光子数(N)。再搭配以定位顺序区分邻近分子,RESI 就能得到近乎无限小的解析度。这种灵活的反覆定位模式,有赖 DNA-PAINT 技术奇特的“不牢固”结合(transient binding)搭配荣曼团队研发的开源影像处理软件Picasso 合力实现。